淀粉酶活性測(cè)定方法的改進(jìn)-李雯

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植物生理學(xué)通訊　　第４１卷　第５期，２００５年１０月655

淀粉酶活性測(cè)定方法的改進(jìn)

李雯１，２　　邵遠(yuǎn)志１　　陳維信２，＊

１

海南大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，�？冢担罚埃玻玻福唬踩A南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院第一文庫(kù)網(wǎng)，廣州５１０６４２

Improved Method for Determining Amylase Activity

LI Wen1,2, SHAO Yuan-Zhi1, CHEN Wei-Xin2,*

College of Life Science and Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China; 2College of Horticulture, South ChinaAgricultural University, Guangzhou 510642, China

提要　　以香蕉果實(shí)為試材，對(duì)常規(guī)的淀粉酶活性的測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)，取得了更好的效果。關(guān)鍵詞　　淀粉酶活性；測(cè)定方法；

改進(jìn)

淀粉酶是反映淀粉分解速度、研究糖代謝規(guī)律的一個(gè)重要指標(biāo)之一。香蕉是典型的貯藏淀粉的果實(shí)，果實(shí)采后其淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖。了解淀粉酶活性的變化規(guī)律對(duì)研究香蕉果實(shí)采后生理及貯藏保鮮十分重要。測(cè)定淀粉酶活性常采用的是酶動(dòng)力學(xué)方法中的化學(xué)法［１］。果實(shí)淀粉酶活性的測(cè)定一般是借鑒文獻(xiàn)２￣４的方法，但這些方法在測(cè)定香蕉果實(shí)淀粉酶活性時(shí)，操作繁瑣，重復(fù)性較差。本文就酶液的提取、反應(yīng)步驟的取舍等方面對(duì)這些方法作了改進(jìn)，取得了較好的效果。

劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭＃玻病　y(cè)定方法

２．２．１　　酶液的提取　　將每一個(gè)重復(fù)的３個(gè)果實(shí)去皮后切碎混勻，稱取其果肉１�。�，置于預(yù)冷的研缽中，加２�。恚填A(yù)冷的０．１�。恚铮臁ぃ蹋睓幟仕崛芤海ǎ穑龋担叮┖蜕倭渴⑸把心ィ瑢驖{移入７�。恚痰碾x心管中，再分別用１�。恚痰模埃薄。恚铮臁ぃ蹋睓幟仕峋彌_液（ｐＨ　５．６）沖洗２次，　于４℃下以１５�。埃埃啊粒珉x心１５ｍｉｎ，上清液轉(zhuǎn)移入另一個(gè)５�。恚屉x心管中，作為酶提取液備用。

２．２．２　　酶活性的測(cè)定　　取潔凈的試管１８支，作好標(biāo)記，每一個(gè)樣品設(shè)１個(gè)對(duì)照。總反應(yīng)體積為０．５ｍＬ，測(cè)定管含０．２�。恚痰拿柑崛∫汉停埃场。恚痰模保サ矸廴芤�；對(duì)照管含０．２�。恚痰拿柑崛∫汉停埃场。恚痰模埃薄。恚铮臁ぃ蹋薄幟仕崛芤海ǎ穑取。担�，　不含底物淀粉）。將試管放入恒溫４０℃的水浴鍋中，保溫３０�。恚椋詈笕〕�，立即加入１．５�。恚痰模模危釉噭┙K止反應(yīng)。再將試管置于沸水浴中１０�。恚椋�，取出后冰浴冷卻。取反應(yīng)液稀釋１０倍，測(cè)定波長(zhǎng)５２０�。睿硖幍奈庵担献鳆溠刻菢�(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出麥芽糖的含量，計(jì)算淀粉酶的總活性。

上述的酶的提取和測(cè)定，與文獻(xiàn)２的常規(guī)方法相比較，有以下４個(gè)改進(jìn)：（１）可用緩沖液作為淀粉酶的提取液和底物淀粉的溶液；（２）將原來的

材料與方法

１　　材料

實(shí)驗(yàn)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。材料為巴西香蕉果實(shí)（Ｍｕｓａ　ｓｐｐ．�。粒粒粒牵颍铮酰�，�。茫幔觯澹睿洌椋螅瑁�，購(gòu)自水果市場(chǎng)。試材選３種成熟度差異非常明顯的果實(shí)進(jìn)行測(cè)定：（１）綠熟硬果，（２）中等黃熟微軟果，（３）黃熟極軟果。所選果實(shí)大小一致、無病蟲害、無機(jī)械傷，每類果實(shí)９個(gè)果，重復(fù)３次。２　　方法

２．１　　試劑配制　　淀粉酶提取緩沖液：０．１�。恚铮臁ぃ蹋睓幟仕崛芤海ǎ穑取。担叮�；�。保サ牡矸廴芤海河茫埃薄。恚铮臁ぃ蹋钡臋幟仕峋彌_液（ｐＨ�。担叮┡渲疲粯�(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（１�。恚纭ぃ恚蹋保弧。�，５－二硝基水楊酸試劑（ＤＮＳ試劑）：　稱�。叮怠。纭。�，５－二硝基水楊酸溶于少量水中，移入１�。埃埃啊。恚倘萘科恐�，加入３２５�。恚獭。病。恚铮臁ぃ蹋薄。危幔希热芤�，再加入４５　ｇ丙三醇，搖勻，冷卻后定容到１�。埃埃啊。恚�。淀粉和麥芽糖為Ｓｉｇｍａ產(chǎn)品，其余試

656植物生理學(xué)通訊　　第４１卷　第５期，２００５年１０月

３次稀釋步驟改為只稀釋１次；（３）不用ＮａＯＨ溶液

終止反應(yīng)，而用ＤＮＳ試劑顯色同時(shí)終止反應(yīng)；（４）耗時(shí)從５�。琛p少到３．５�。琛�

結(jié)果是一致的，說明改進(jìn)方法可以反映香蕉果實(shí)后熟過程中淀粉酶活性的變化情況，具有可操作性；（２）常規(guī)方法測(cè)得的淀粉酶活性比改進(jìn)方法測(cè)得的低，２種方法測(cè)得的３種成熟度果實(shí)的酶活性分別相差０．３３８、０．３５１和０．２５１　ｍｇ·ｇ－１（ＦＷ）·ｈ－１，表明改進(jìn)的方法可測(cè)得更高的淀粉酶活性；（３）３種成熟度果實(shí)中淀粉酶活性的標(biāo)準(zhǔn)誤值和變異系數(shù)都小于常規(guī)方法，說明改進(jìn)的方法其實(shí)驗(yàn)誤差比常規(guī)方法小。

結(jié)果與討論

從表１可以看出：（１）綠熟硬果、中等黃熟微軟果、黃熟極軟果３種不同成熟度的果實(shí)淀粉酶活性表現(xiàn)出低、高、低的趨勢(shì)，各成熟度果實(shí)間存在極顯著差異（Ｐ＜０．０１），２種測(cè)定方法得到的

表１　　香蕉果實(shí)中淀粉酶活性測(cè)定方法的比較

酶活性／ｍｇ·ｇ－１（ＦＷ）·ｈ－１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　標(biāo)準(zhǔn)誤　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　變異系數(shù)／％

果實(shí)類別　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　常規(guī)方法　　　　　　　　　　　　　　　　改進(jìn)方法　　　　　　　　　　　　　常規(guī)方法　　　　　　　　　　　　　　改進(jìn)方法　　　　　　　　　　　　常規(guī)方法　　　　　　　　　　　　　　改進(jìn)方法

綠熟硬果中等黃熟微軟果黃熟極軟果

１．５３４Ｂ２．１４７Ａ０．５５５Ｃ

１．８７２Ｂ２．４９８Ａ０．８０６Ｃ

０．３０３０．３３００．２８７

０．１２６０．１９６０．１１５

１９．７６０１５．４１２５１．７１２

６．７４８　�。罚福常矗保矗玻矗�

常規(guī)方法（對(duì)比測(cè)定）使用文獻(xiàn)２的方法。

酶活性的測(cè)定受多種因素的影響［５］。通過以上實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為還須特別注意以下幾點(diǎn)：（１）取樣前，要把水浴鍋的水溫調(diào)整到需要的溫度，為后續(xù)的反應(yīng)過程做好準(zhǔn)備；（２）研磨樣品和轉(zhuǎn)移樣品時(shí)，速度要快，準(zhǔn)確，以避免樣品損失帶來的誤差；（３）酶反應(yīng)時(shí)，先往反應(yīng)管中加底物溶液，后加酶提取液，而且一次不要做太多的樣品，以避免加樣先與后的時(shí)間差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；（４）測(cè)定吸光值時(shí)，先要檢查比色杯是否有差異，哪怕是微小的差異也要避免，以防止結(jié)果呈現(xiàn)負(fù)值的現(xiàn)象發(fā)生（由于比色杯本身的差異可造

成對(duì)照管的吸光值大于樣品管的吸光值）。

參考文獻(xiàn)

１２３４

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