包涵體復(fù)性相關(guān)資料

一、 包涵體：

1.1包涵體的定義、組成與特性：

包涵體是指細(xì)菌表達的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。 一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，具有很高的密度（約1.3mg/ml），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。NMR等新技術(shù)的應(yīng)用表明包涵體具有一定量的二級結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動階段中具有一定的作用。[1]

1.2包涵體的形成：

主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。

1.2.1、基因工程菌的表達產(chǎn)率過高，超過了細(xì)菌正常的代謝水平，由于細(xì)菌的δ因子的蛋白水解能力達到飽和，使之表達產(chǎn)物積累起來。研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等。

1.2.2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。

1.2.3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。

1.2.4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。

1.2.5、蛋白質(zhì)在合成之后，于中性pH或接近中性pH的環(huán)境下，其本身固有的溶解度對于包涵體的形成比較關(guān)鍵，即是說，有的表達產(chǎn)率很高，如Aspartase和Cyanase,表達產(chǎn)率達菌體蛋白的30%,也不形成包涵體，而以可溶形式出現(xiàn)。[2]

1.2.6、在細(xì)菌分泌的某個階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。

1.3包涵體破菌、分離、洗滌及溶解

1.3.1基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用：機械破碎、超聲破碎：單純超聲破碎，在小規(guī)模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，這樣部分未破碎細(xì)胞與包涵體混在一起，給后期純化帶來困難。因此，在較大規(guī)模純化時先用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法，可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學(xué)方法破碎使細(xì)菌裂解,然后以5000-20000g 15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。

1.3.2洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑,過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。[3]

1.3.3溶解：一般用強的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl 6M），通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因為鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲�；�，特別是在堿性pH值下長期保溫時�；蛴萌ス竸�，如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。Kandula Suntha等人用TritonX-100來溶解

Zymononas mobilis levansucrase包涵體蛋白。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、

第一文庫網(wǎng) 二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。還原劑的使用濃度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文獻使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用

5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。[4]

二、復(fù)性：

由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理條件，使蛋白的高級結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。 通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復(fù)性過程開始，到2M 左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。

2.1包涵體蛋白復(fù)性方法

2.1.1稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。

2.1.2透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。

2.1.3超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。

2.1.4柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復(fù)性，大致可分成疏水柱復(fù)性及凝膠柱復(fù)性兩類。其中的凝膠柱復(fù)性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子篩填料，柱較長（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復(fù)性回收率高（高達90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)�。ㄒ话阄灞蹲笥遥�[5]

2.1.5高蛋白質(zhì)濃度下的復(fù)性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中，使得蛋白質(zhì)在加入過程中或加入階段之間有足夠的時間進行折疊復(fù)性；二是采用溫度跳躍式復(fù)性，即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時，迅速提高溫度以促進蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。 此外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用蛋白質(zhì)的復(fù)性。

2.2包涵體蛋白復(fù)性效率

復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)

本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M行復(fù)性的方法如IL-11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點幾，如在純化IL-2時以十二烷基硫酸鈉溶液中加入銅離子（0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2）的方法，25-37°C下反應(yīng)3小時，再EDTA至1m mol/l終止反應(yīng)，復(fù)性后的二聚體低于1%。[6]一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。

2.2.1影響復(fù)性效率的因素：

2.2.1.1蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度：正確折疊的蛋白質(zhì)的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質(zhì)的濃度是使蛋白質(zhì)聚集的主要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復(fù)性液中過快，容易形成絮狀沉淀，可能是蛋白重新凝聚的緣故。所以我們采用再水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白，使變性蛋白在復(fù)性液中始終處于低濃度狀態(tài)。

2.2.1.2pH和溫度：復(fù)性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低復(fù)性效率，最適宜的復(fù)性pH值一般是8.0-9.0。[12]

此外，影響復(fù)性效率的因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。

2.2.2提高包涵體蛋白的復(fù)性產(chǎn)率

2.2.2.1氧化-還原轉(zhuǎn)換系統(tǒng)

對于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程應(yīng)能夠促使二硫鍵形成。常用的方法有：空氣氧化法、使用氧化交換系統(tǒng)、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.

最常用的氧化交換系統(tǒng)是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、

DTT/GSSG、DTE/GSSG等也都有應(yīng)用。氧化交換系統(tǒng)通過促使不正確形成的二硫鍵的快速交換反應(yīng)提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率。通常使用1-3m mol/l還原型巰基試劑,還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為10：1—5：1。[7]

2.2.2.2添加低分子化合物

低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折疊，但可能通過破壞錯誤折疊中間體的穩(wěn)定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù)性產(chǎn)率。如鹽酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑。蛋白質(zhì)的輔因子、配基或底物亦可起到很好的促折疊作用，如蛋白質(zhì)的輔因子Zn2+或Cu2+可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊中間體,從而防止了蛋白質(zhì)的聚集，加入濃度大于0.4 mol/lTris緩沖液可提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。濃度為0.4-0.6M L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度。成功的應(yīng)用于很多蛋白如t-PA的復(fù)性中，可以抑制二聚體的形成。

NDSBs是近年來出現(xiàn)的可促進蛋白復(fù)性的新家族, NDSBs由一個親水的硫代甜菜堿及一個短的疏水集團組成，故不屬于去垢劑,不會形成微束,易于透析去除，目前，常用的有NDSB-195，NDSB-201，NDSB-256。[8]

2.2.2.3PEG-NaSO4兩相法

用PEG和NaSO4作為成相劑,然后加入鹽酸胍，再把變性的還原的蛋白質(zhì)溶液加入其中

進行復(fù)性,但這種方法需復(fù)性的變性蛋白質(zhì)的濃度必須低。[9]

2.2.2.4分子伴侶和折疊酶等

這類蛋白質(zhì)主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰-輔氨酰順反異構(gòu)酶、分子伴侶、FK506結(jié)合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的`平衡，而且可在體外促進蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。[13]

2.2.2.5其它

提高復(fù)性率的策略還有許多，如：非離子型去垢劑，尤其是離子型或兩性離子去垢劑或表面活性劑CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進作用；待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助其復(fù)性；多聚離子化合物如肝素不僅可以促進蛋白質(zhì)的作用，而且具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用。[10]

2.3復(fù)性效果的檢測：

根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進行檢測。

2.3.1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。

2.3.2、光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。

2.3.3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，

2.3.4、生物學(xué)活性及比活測定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。

2.3.5、黏度和濁度測定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。

2.3.6、免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。[11]

在正常的生理條件下，組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都能以獨特的方式進行折疊，形成自己特有的空間結(jié)構(gòu)，以執(zhí)行某一些生命活動。當(dāng)外界環(huán)境改變時，可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體有害的反應(yīng)，引起構(gòu)象病的發(fā)生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復(fù)性過程中發(fā)生聚集的機制尚不清楚，許多已建立的高效復(fù)性方法是在反復(fù)實驗和優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律：如聚集的發(fā)生是由鏈間的疏水相互作用介導(dǎo)、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識建立了一些重組蛋白質(zhì)高效復(fù)興性的方法。相信隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)和新設(shè)備的發(fā)展和完善，在不久的將來，預(yù)測和設(shè)計最佳復(fù)性方案將成為可能。

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