- 相關(guān)推薦
多聯(lián)吡啶螯合物反相高效液相色譜法分離測定銅(Ⅱ)、鈷(Ⅱ)、汞(Ⅱ)
螯合物的穩(wěn)定常數(shù)都非常高,許多螯合反應(yīng)都是定量進(jìn)行的,可以用來滴定。使用螯合物還可以掩蔽金屬離子。下面是小編收集整理的多聯(lián)吡啶螯合物反相高效液相色譜法分離測定銅(Ⅱ)、鈷(Ⅱ)、汞(Ⅱ)，歡迎閱讀與收藏。
（一）基體
親和色譜中使用的基體材料可分為天然有機(jī)高聚物、合成有機(jī)聚合物和無機(jī)載體材料三類。此外基體在偶聯(lián)間隔臂之前還需進(jìn)行活化預(yù)處理。
作為親和色譜的基體材料應(yīng)具備以下條件：
①具有一定的剛性、撓性和機(jī)械強(qiáng)度；
�、诰哂性谝欢�,5值范圍的化學(xué)穩(wěn)定性，不溶于普通試劑；
�、郾砻婢哂幸欢ǖ幕钚怨倌軋F(tuán)，如羥基、胺基、醚基等，可被適當(dāng)?shù)脑噭┗罨?/p>
當(dāng)使用基體材料時(shí)，還應(yīng)了解它們的基本物理性質(zhì)，如粒度、表面積、相對密度、孔徑和孔容等必要的參數(shù)。
1.基體的分類
�。�1）天然有機(jī)高聚物
親和色譜早期使用的基體材料主要是由天然有機(jī)高聚物制成的軟質(zhì)凝膠，具有三維晶格結(jié)構(gòu)或多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠內(nèi)未被骨架占據(jù)的空間含有截留的液體，使其保持柔軟。凝膠顆粒呈均勻的球形，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，并具有化學(xué)惰性，常用的凝膠材料為：
�、倨暇厶牵―extran）它是由葡萄糖分子以α-1,6鍵相連、具有空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合物，分子量大于)+。市售SephadexG(Pharmacia，瑞典），是由精制葡萄糖與交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)共聚制得的球狀聚合物。0值表示不同的交聯(lián)度，G值愈大，孔徑愈大，G后邊的數(shù)字還表示每克干膠膨脹時(shí)吸水量的10倍，如0—56表示每克干膠可吸附水2.5g。SephadexG型的物理性質(zhì)和應(yīng)用范圍見表6-2-2，其中,SephadexG-200是理想的適用于分離細(xì)胞組織的親和色譜基體。SephadexG可耐受110℃高溫和0.5mol/LNaOH溶液處理，其骨架上眾多的羥基可以活化用于偶聯(lián)其他化合物。
葡聚糖①和Sephadex②的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
�、侪傊牵ˋgarose）它是由D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖交替連接的鏈狀多糖，糖鏈間通過氫鍵形成穩(wěn)定的多糖螺旋束網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
瓊脂糖凝膠是親水、疏松的，分子量超過78+的生物大分子可自由進(jìn)出凝膠顆粒。它具有良好的化學(xué)惰性，可在0-40℃和pH=4-9的條件下使用，不發(fā)生離子交換，對生物大分子僅產(chǎn)生很低的特異性吸附。它的機(jī)械強(qiáng)度高于葡聚糖，分離蛋白質(zhì)的分子量范圍可達(dá)10^8。
瓊脂糖凝膠的不足之處是它不宜干燥和反復(fù)膨脹使用，若長期保存應(yīng)添加無害的抑菌劑（0.2%疊氮鈉、甲苯），并在8℃以下不結(jié)冰的環(huán)境下保存，若冰凍會導(dǎo)至凝膠球的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可逆的破壞。
瓊脂糖凝膠的商品型號為Sepharose（Pharmacia，瑞典）和BioGelA（Bio-Rad，美國），近來使用2，3)二溴丙醇作交聯(lián)劑制得的SepharoseCL（Pharmacia，瑞典）可經(jīng)受110-120℃高壓滅菌處理，在pH-3-4介質(zhì)中使用，其穩(wěn)定性大大提高，可用含高濃度脲、鹽酸胍、有機(jī)溶劑和非離子型表面活性劑的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。常用的瓊脂糖商品性能及應(yīng)用范圍見表6-2-3。最新報(bào)道的將瓊脂糖先與含多環(huán)氧基長鏈交聯(lián)劑（如聚乙二醇）進(jìn)行交聯(lián)，然后再用短鏈交聯(lián)劑（如2，3-二溴丙醇）進(jìn)行第二次交聯(lián)，可制得凝膠商品為Superose,，它的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，當(dāng)用0.1mol/LHCL及0.1mol/LNOaoh在40℃處理14天后，色譜性能無明顯改變，并能承受70%甲酸及30%乙腈的處理，它可作為高效液相親和色譜的基體材料。
表6-2-3瓊脂糖商品性能及應(yīng)用范圍(略）
�。�2）合成有機(jī)高聚物
在親和色譜中使用的合成有機(jī)高聚物，其表面應(yīng)具有親水性，且粒度均勻，具有多孔或非多孔結(jié)構(gòu)，可分為以下幾種類型的高聚物。
�、倬郾０芳捌溲苌锞郾０肥怯蓡误w丙烯酰胺、交聯(lián)劑N，N-亞甲基二丙烯酰胺，在引發(fā)劑N，N，N，N-四甲基乙二胺和過硫酸銨存在下聚合而成，它為具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，其制備反應(yīng)如下：
常用商品型號為BioGelP（Bio-Rad，美）軟質(zhì)球形凝膠，其中P表示交聯(lián)度，P值愈大表示交聯(lián)度高，其孔徑也愈大。它可在pH=2-10的介質(zhì)中使用，有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，其主要優(yōu)點(diǎn)是具有大量可修飾的酰胺官能團(tuán)，可用多種方法進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；不足之處在于機(jī)械強(qiáng)度較差，網(wǎng)孔小，不宜用作生物大分子的分離。表6-2-4為Bio-GelP型商品的主要性能和應(yīng)用范圍。
聚丙烯酰胺——瓊脂糖共聚物Utroggel（LKB/，瑞典）是一種新型聚合物，它具有聚丙烯酰胺的三維晶格，其空隙內(nèi)又含有瓊脂糖凝膠，并具有可功能化的酰胺基和羥基，粒度為60-140μm，機(jī)械性能較強(qiáng)，比常用的凝膠基體耐壓，可在較高流速下操作，表6-2-5列出Utroggel的技術(shù)規(guī)格。
由N，N-亞甲基二丙烯酰胺與丙烯基葡聚糖共聚生成的Sephacryl（Phamarcia，瑞典）硬質(zhì)凝膠，粒度25-75μm，可在pH=3-11介質(zhì)中使用，于120℃、pH=7的環(huán)境中消毒。它用0.2mol/LNaOH室溫處理100h，凝膠的多孔性和流速無變化，并可用含6mol/L鹽酸胍和十二烷基磺酸鈉（SDS）的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，Sephacryl-2-6系列性質(zhì)見表6。
以N-丙烯酰基-2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇為單體，以N，N-二乙烯基酒石酸二酰胺為交聯(lián)劑，聚合生產(chǎn)的Trisacryl（IBFBiotechnics,法）凝膠，具有良好的親水性、低的非特異性吸附，良好的機(jī)械性能和化學(xué)穩(wěn)定性，可在pH=1-11介質(zhì)中使用，可耐受變性劑和有機(jī)溶劑，并具有抵抗微生物侵蝕能力，其骨架主鏈上的羥甲基官能團(tuán)可用多種方法活化，它對配位體蛋白質(zhì)的鍵合容量高于瓊脂糖基體，現(xiàn)已獲愈來愈廣泛的應(yīng)用。
②甲基丙烯酸酯共聚物聚甲基丙烯酸羥乙酯是由單體甲基丙烯酸-2-羥基乙酯（HEMA）與交聯(lián)劑二甲基丙烯酸-1,2-亞乙基酯（EDMA）共聚生成的、具有剛性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏水球狀顆粒，粒徑10μm，有良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，在pH=2-13介質(zhì)中使用，可耐2mol/LHCL或NaOH清洗，加熱至170℃進(jìn)行高壓滅菌而不分解，它富含羥基可用多種方法活化，可作為高效液相色譜固定相使用。另一種聚甲基丙烯酸縮水甘油酯是甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、季戊四醇二甲基丙烯酸酯（PDMA）和聚乙二醇（PEG）三者的共聚物，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，粒徑10μm，可在pH=2-12介質(zhì)中使用，可耐受脲、鹽酸胍、有機(jī)溶劑的處理，此凝膠富含醇羥基和醚基，可用多種方法活化，常用于高效親和色譜的是TSKToyopear(ToyoSodaCorporation，日）HW-65F凝膠。
�、垭迦渲�1，2-丙二醇介質(zhì)中，尿素與甲醛在硝酸鐵催化劑存在下，40℃行縮聚反應(yīng)4h，可制得單分散非多孔微球，粒徑約2-4μm，可在pH=1-13介質(zhì)中使用，顯示良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，脲醛樹脂微球表面的酰胺基團(tuán)可用多種方法活化，已作為高效親和色譜固定相的基體。
④高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物交聯(lián)度達(dá)40%-90%的苯乙烯——二乙烯基苯共聚制得的全多孔微球，粒度10-40μm，孔徑30-100nm，它是在80年代以后采用種子聚合法制成的新型基體材料，可在pH=1-14的介質(zhì)中使用，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，可直接作為高效反相色譜固定相使用，其表面呈強(qiáng)疏水性，可經(jīng)磺化或氯甲基化反應(yīng)后，偶聯(lián)適當(dāng)?shù)拈g隔臂和配位體，并已在高效親和色譜中獲得愈來愈多的應(yīng)用。
應(yīng)當(dāng)指出由高交聯(lián)苯乙-二乙烯基苯共聚物制得的灌注色譜固定相——POROS（PerSptiveBiosystems，美），開辟了對生物大分子分離的新途徑，它在10-20μm的球形顆粒上，制備出具有600-800nm的貫流大孔并與80-150nm的滲流小孔相溝通的特殊網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可在廣泛的x;值范圍、低柱壓下實(shí)現(xiàn)生物大分子的快速分離。此類填料經(jīng)磺化或氯甲基化處理后，也可用于制取高效親和色譜固定相。
近年還研制出高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯非多孔共聚微球，其粒徑僅2-5μm，可裝填于φ4.6mmx5cm的短色譜柱中，也可實(shí)現(xiàn)生物大分子的快速分離。
（3）無機(jī)載體材料
現(xiàn)在高效液相色譜中廣泛采用的無機(jī)載體材料是Sio2，其中粒徑5-10μm、孔徑30-100nm的全多孔Sio2微球，在高效親和色譜中使用較多，近年為實(shí)現(xiàn)生物大分子的快速分離，也逐漸使用2-5μm非多孔Sio2微球。
80年代末期不少色譜工作者已探討使用機(jī)械強(qiáng)度高、在廣泛pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定的ZrO2、Tio2、CeO2和Wo3作為高效親和色譜的新型載體，并研制成功全多孔微球和非多孔微球的制造方法，已取得可喜的成果。
2.基體材料的活化——功能化反應(yīng)和偶聯(lián)反應(yīng)
前述各種基體材料皆需進(jìn)行活化處理后，才能與間隔臂聯(lián)接，各種活化基體的方法如下：
�。�1）無機(jī)載體材料的活化
�、倩罨椒ㄒ許io2為代表的無機(jī)載體材料，經(jīng)鹽酸處理后，其表面含大量硅羥基，此羥基可與活化試劑——硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)，使基體功能化，而成為表面聯(lián)接有反應(yīng)活性官能團(tuán)的活化基體。如經(jīng)鹽酸處理過的Sio2與γ-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行的活化反應(yīng)為：
表6-2-7常用硅烷偶聯(lián)劑(略）
（2）合成高聚物基體的活化對聚丙烯酰胺基體可用含雙官能團(tuán)的活化試劑，如戊二醛、乙二胺、N-羥基丁二酰亞胺等來進(jìn)行活化，活化反應(yīng)如下：
對苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，常用氯甲基化反應(yīng)、磺化反應(yīng)、硝化反應(yīng)進(jìn)行活化，活化反應(yīng)如下：
�。�3）多糖聚合物的活化
瓊脂糖、葡聚糖均含有大量羥基，可與含親電子基團(tuán)的活化試劑，如溴化氰、環(huán)氧氯丙烷、二乙烯基砜、丁二酰氯等反應(yīng)，進(jìn)行活化，活化反應(yīng)如下：
（二）間隔臂
在親和色譜固定相中，需通過間隔臂將配位體聯(lián)接在基體上，由于間隔臂占據(jù)一定的機(jī)動(dòng)空間，當(dāng)配位體與被測定的生物分子（尤其是生物大分子）產(chǎn)生親和作用時(shí)，有利于克服存在的空間阻礙作用。
當(dāng)粒度小、孔徑小的基體聯(lián)接小分子配位體時(shí)，或當(dāng)大分子配位體比較密集地分布在基體上時(shí)，其與被測定生物分子的親和作用，會受到空間阻礙作用的影響。為了克服空間阻礙作用，并實(shí)現(xiàn)配位體與被測定生物分子間最佳的相互作用，必須解決如下兩個(gè)主要問題。
1.間隔臂長度的選擇
關(guān)于間隔臂的長度，經(jīng)過前人大量實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)確定，對低親和能力的配位體或當(dāng)作用物為生物大分子（蛋白質(zhì)）時(shí)，在基體和配位體之間的間隔臂長度約為2-12個(gè)原子的距離。為獲得最佳的親和作用，它們之間需插入4-6個(gè)亞甲基的橋鍵。對具有高親和能力的配位體或當(dāng)作用物為表觀分子量低的生物分子時(shí)，對間隔臂長度的要求就不如上述系統(tǒng)那樣嚴(yán)格。
2.用作間隔臂的化合物的選擇
對用作間隔臂的化合物，文獻(xiàn)上推薦使用具有NH2(CH2)nr通式的ω-氨烷基化合物。通式中R可為羧基、羥基、胺基或配位體自身。此類化合物分子中含n個(gè)亞甲基（—CH2—）疏水性基團(tuán)。
具有疏水性基團(tuán)的間隔臂分子會與配位體或作用物生物分子之間產(chǎn)生非特異性吸附作用，干擾配位體與生物分子間特效性的鎖匙相互作用，為消除非特異性吸附，可在沿間隔臂分子的長軸方向的某些原子上偶聯(lián)亞胺基（—NH2—）、羥基（—OH）等官能團(tuán)，以破壞單一的疏水區(qū)域，增強(qiáng)親水性。
顯然，當(dāng)使用親水性強(qiáng)的間隔臂分子來代替疏水性間隔臂分子時(shí)，會顯著降低對鎖匙特效親和作用的干擾。有些親和色譜分離實(shí)例還表明，當(dāng)存在少量非特異性吸附現(xiàn)象時(shí)，親和色譜分離卻會得到最有價(jià)值的分析結(jié)果。因此在親和色譜分析中，仔細(xì)控制特效性親和作用和非特異性疏水作用的平衡，會比完全消除非特異性吸附作用更有利。
間隔臂分子長度的選擇，可依據(jù)前述慣例或依據(jù)制備的難易程度加以考慮，只要獲得最佳分離效果，就不必再增加臂長。間隔臂過長，會因撓性引起折疊或纏繞，也會使能與生物分子作用的配位體密度減小，并增加非特異性吸附或降低色譜柱柱效。
用作間隔臂的化合物結(jié)構(gòu)，與活化基體時(shí)使用的活化試劑相似，皆為含有雙官能團(tuán)的化合物，其分子一端與活化基體聯(lián)接，另一端將與配位體偶聯(lián)。
可作為疏水性間隔臂的有機(jī)化合物有：
作為親水性間隔臂的有機(jī)化合物有：小肽類如，由兩個(gè)甘氨酸和一個(gè)賴氨酸縮合的三肽，在實(shí)際使用中應(yīng)根據(jù)親和色譜分離目的的不同而恰當(dāng)?shù)牟捎檬杷曰蛴H水性間隔臂。
�。ㄈ┡湮惑w
在親和色譜固定相上鍵聯(lián)的配位體，可為染料配位體、定位金屬離子配位體、包合配合物配位體、生物特效配位體、電荷轉(zhuǎn)移配位體和共價(jià)配位體，以下分別予以闡述。
染料配位體
三嗪活性染料為主要使用的染料配位體（DyeLigand），此類染料分子的結(jié)構(gòu)與生物酶的天然底物相似，故可與酶或蛋白質(zhì)的活性作用點(diǎn)結(jié)合而用于親和色譜。
氯原子被取代基依次置換后，其化學(xué)活性顯著下降。當(dāng)反應(yīng)溫度為0-5℃時(shí)，第一個(gè)氯原子可被置換；當(dāng)反應(yīng)溫度為40-50℃時(shí)，第二個(gè)氯原子可被置換；第三個(gè)氯原子需加熱90℃以上才可被置換。
三嗪活性染料產(chǎn)品主要為瑞士汽巴8嘉基公司（Ciba-Geigy）生產(chǎn)的$-9/;<=0系列和英國帝國化學(xué)工業(yè)公司（ICI）生產(chǎn)的Procion系列。它們可分為三種不同類型的產(chǎn)品，即二氯三嗪型、一氯三嗪型和一氟三嗪型。
【多聯(lián)吡啶螯合物反相高效液相色譜法分離測定銅(Ⅱ)、鈷(Ⅱ)、汞(Ⅱ)】相關(guān)文章：
高效液相色譜法測定西瓜中殘留的噻菌銅04-30
反相高效液相色譜法同時(shí)測定黃芪中的4種酚酸04-26
反相高效液相色譜法測定玉米中玉米赤霉烯酮04-29