采用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因重組腺病毒載體

目的:采用基于attLXattR的λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的GatewayTM技術(shù)構(gòu)建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因重組腺病毒栽體(Ad-hBMP-2).方法:從pcDNA3.1質(zhì)粒中獲取目的基因hBMP-2片段,連入帶attL1、attL2位點(diǎn)的入門載體pENTRTM11中.形成入門克隆,將入門克隆與帶attR1、attR2位點(diǎn)的目的載體Ad/CMV/V5-DEST在高效重組酶作用下發(fā)生體外重組形成表達(dá)克隆ad-BMP-2,經(jīng)鑒定將ad-BMP-2線性化后轉(zhuǎn)入293A細(xì)胞包裝,通過(guò)細(xì)胞裂解法獲得人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的基因重組腺病毒珠Ad-hBMP-2,將其擴(kuò)增,采用western blotting技術(shù)分析目的蛋白表達(dá).結(jié)果:經(jīng)酶切及測(cè)序證實(shí)目的基因BMP-2片段按正確方向重組入目的載體中,帶BMP-2的目的栽體在293A細(xì)胞中包裝成功,獲得成熟的病毒顆粒,測(cè)得病毒滴度為2.5×109pfu/ml.western blotting結(jié)果證實(shí)Ad-hBMP-2在293A細(xì)胞中高效表達(dá)hBMP-2蛋白.結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)首次利用基于λ噬菌體的住點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的GatewayTM技術(shù)成功構(gòu)建了Ad-hBMP-2,該技術(shù)與傳統(tǒng)構(gòu)建方法比較具有高效性和靈活性,為進(jìn)一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2進(jìn)行骨基因治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

作 者： 蔣紅梅 龍潔 湯煒 田衛(wèi)東 劉磊 林云鋒 王杭 李鵬 JIANG Hong-mei LONG Jie TANG Wei TIAN Wei-dong LIU lei LIN Yun-feng WANG Hang LI Peng   作者單位： 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院,成都,610041  刊 名： 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展  ISTIC 英文刊名： PROGRESS IN MODERN BIOMEDICINE  年，卷(期)： 2008 8(2)  分類號(hào)： Q78  關(guān)鍵詞： 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2   GatewayTM技術(shù)   重組腺病毒  

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