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革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析
研究了菌齡、涂片厚度、媒染時(shí)間、乙醇脫色程度等對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，大腸桿菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)時(shí)間不宜超過25小時(shí)，以下是小編為大家整理的革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析，僅供參考，希望能夠幫助大家。
革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析
革蘭氏染色應(yīng)用(原理，方法，步驟，優(yōu)缺點(diǎn))
1. 革蘭氏染色液簡(jiǎn)介：
革蘭氏染色是一種差異染色方法，用于根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁的特性將細(xì)菌分為兩組（革蘭氏陽性和革蘭氏陰性）之一。它也被稱為革蘭氏染色法或革蘭氏法。該程序是以發(fā)明該技術(shù)的丹麥細(xì)菌學(xué)家漢斯·克里斯蒂安·格拉姆命名的。
2. 革蘭氏染色的工作原理
革蘭氏染色方法基于某些細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖之間的反應(yīng)。革蘭氏染色包括給：細(xì)菌染色，用染劑固定顏色，使細(xì)胞脫色，并進(jìn)行復(fù)染。
a. 結(jié)晶紫與肽聚糖結(jié)合，將細(xì)胞染成紫色。革蘭氏陽性細(xì)胞和革蘭氏陰性細(xì)胞的細(xì)胞壁中都含有肽聚糖，所以最初，所有細(xì)菌都會(huì)染成紫色。
b. 碘和碘化鉀用作染色劑或固定劑。革蘭氏陽性細(xì)胞形成結(jié)晶紫碘復(fù)合物。
c. 用酒精或丙酮使細(xì)胞脫色。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中的肽聚糖要少得多，因此這一步驟基本上使其無色，而革蘭氏陽性細(xì)胞中只有一些顏色被去除，這些細(xì)胞含有更多的肽聚糖（細(xì)胞壁的60-90%）。革蘭氏陽性細(xì)胞的厚細(xì)胞壁在脫色步驟中脫水，導(dǎo)致細(xì)胞收縮，并將染色碘復(fù)合物滯留在細(xì)胞內(nèi)。
4. 脫色步驟后，應(yīng)用復(fù)染（通常是藏紅，但有時(shí)是紫紅色）將細(xì)菌染成粉紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都會(huì)染上粉紅色的污漬，但在革蘭氏陽菌的深紫色上看不到。如果正確執(zhí)行染色程序，革蘭氏陽性菌將為紫色，而革蘭氏陰性菌將為粉紅色。
3. 革蘭氏染色技術(shù)的目的
用光學(xué)顯微鏡觀察革蘭氏染色的結(jié)果。由于細(xì)菌是有色的，因此不僅可以確定它們的革蘭氏染色組，還可以觀察到它們的形狀、大小和聚集模式。這使得革蘭氏染色對(duì)于醫(yī)療診所或?qū)嶒?yàn)室來說是一種有價(jià)值的診斷工具。雖然染色可能無法明確識(shí)別細(xì)菌，但通常知道它們是革蘭氏陽性還是革蘭氏陰性就足以開有效抗生素的處方。
4. 革蘭氏染色技術(shù)的缺點(diǎn)
有些細(xì)菌可能是gram-variable or gram-indeterminate。然而，即使這些信息也可能有助于縮小細(xì)菌的范圍。當(dāng)培養(yǎng)物不到24小時(shí)時(shí)，該技術(shù)最可靠。雖然它可以用于肉湯培養(yǎng)（但最好先離心處理）。該技術(shù)的主要局限性是，如果在該技術(shù)中出錯(cuò)，則會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。要產(chǎn)生可靠的結(jié)果，需要實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和技能。此外，傳染源可能不是細(xì)菌。真核病原體染色為革蘭氏陰性。然而，除真菌（包括酵母）外，大多數(shù)真核細(xì)胞在這個(gè)過程中都無法粘附在載玻片上。
5. 革蘭氏染色所需材料
※ 結(jié)晶紫（主色）
※ 革蘭氏碘液（媒介染劑，用于將結(jié)晶紫固定在細(xì)胞壁中）
※ 乙醇或丙酮（脫色劑）
※ 藏紅花（二次染色或復(fù)染色）
※ 水壺或滴管瓶中的水
※ 顯微鏡載玻片
※ 復(fù)合顯微鏡
6. 革蘭氏染色步驟
a. 將一小滴細(xì)菌樣本放在載玻片上。將細(xì)菌通過本生燈的火焰加熱三次，將細(xì)菌固定在載玻片上。加熱過多或時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)融化細(xì)菌細(xì)胞壁、扭曲其形狀，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。如果加熱太少，細(xì)菌會(huì)在染色過程中從載玻片上洗掉。
b. 用滴管將原色（結(jié)晶紫）涂在載玻片上，讓其靜置1分鐘。用不超過5秒鐘的水輕輕沖洗載玻片，以去除多余的污漬。沖洗時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)去除太多顏色，而沖洗時(shí)間不夠長(zhǎng)可能會(huì)使革蘭陰性細(xì)胞上殘留太多污漬。
c. 用滴管將革蘭氏碘涂在載玻片上，將結(jié)晶紫固定在細(xì)胞壁上。讓它靜置1分鐘。
d. 用酒精或丙酮沖洗載玻片約3秒鐘，然后立即用水輕輕沖洗。革蘭氏陰性細(xì)胞將失去顏色，而革蘭氏陽性細(xì)胞將保持紫色或藍(lán)色。然而，如果脫色劑打開時(shí)間過長(zhǎng)，所有細(xì)胞都會(huì)失去顏色！
e. 涂上第二層著色劑藏紅花，靜置1分鐘。用水輕輕沖洗，沖洗時(shí)間不得超過5秒。革蘭氏陰性細(xì)胞應(yīng)染成紅色或粉紅色，而革蘭氏陽性細(xì)胞仍將呈現(xiàn)紫色或藍(lán)色。
f. 使用復(fù)合顯微鏡查看幻燈片。可能需要500倍至1000倍的放大倍數(shù)來區(qū)分電池形狀和排列。
影響革蘭氏染色結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。
1.試劑影響。首先應(yīng)確保使用的試劑須有效。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗(yàn)收到存放、使用、過期后的廢棄處理都應(yīng)有嚴(yán)格規(guī)定。
2.染色菌的選擇。菌齡對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的影響是十分大的。染色過程中選擇的菌應(yīng)是處于活躍生長(zhǎng)期，這樣的細(xì)菌活性強(qiáng)，生理特征明顯，染色結(jié)果準(zhǔn)確度高，一般情況下不會(huì)出現(xiàn)誤差。培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的革蘭氏陽性菌，由于細(xì)胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細(xì)胞壁通透性增加，就會(huì)呈現(xiàn)出假陰性。
3.涂菌的狀態(tài)。在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應(yīng)該在無菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過程中，若是菌體堆積，也會(huì)極大影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細(xì)胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。同時(shí)，在初染、媒染及復(fù)染的過程中，應(yīng)將染液覆蓋整個(gè)菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在涂片過程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達(dá)到最佳效果。
4.媒染時(shí)間。媒染時(shí)間對(duì)革蘭氏陰性菌的染色結(jié)果有很大影響。由于媒染時(shí)間過長(zhǎng)，結(jié)晶紫在碘液長(zhǎng)時(shí)間作用下過分牢固結(jié)合在菌體細(xì)胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會(huì)導(dǎo)致這種假陽性的效果。媒染時(shí)間控制在50-60s為宜。
5.酒精脫色。酒精脫色也是一個(gè)對(duì)結(jié)果影響較大的操作過程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌最主要的差異是細(xì)胞壁肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖成分會(huì)被酒精溶解，增大了細(xì)胞壁的通透性，結(jié)晶紫及碘復(fù)合物就很快被酒精洗脫，之后就會(huì)被沙黃復(fù)染呈紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無法進(jìn)入，這樣結(jié)晶紫和復(fù)合物就無法洗脫出來使細(xì)胞呈紫色。因此，酒精脫色時(shí)間短，脫色效果不佳，會(huì)導(dǎo)致陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和復(fù)合物不能有效的全部洗脫出來，就會(huì)出現(xiàn)明顯的誤差，使陰性菌出現(xiàn)假陽性。而洗脫時(shí)間過長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致陽性菌的細(xì)胞壁被酒精破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的紫色被洗脫，呈現(xiàn)假陰性。洗脫時(shí)間應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制在20s-30s之間，同時(shí)保證洗脫效果。
革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需嚴(yán)格控制的幾個(gè)方面：
染色菌必須是在其活躍期內(nèi)，
涂布狀態(tài)不可太厚，
媒染時(shí)間嚴(yán)格控制在50s-60s之間，
脫色時(shí)間嚴(yán)格控制在20s-30s。
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