牙鲆腦中促性腺激素釋放激素受體的克隆和鑒定

GnRH(gonadotropin-releasing hormone)是下丘腦-垂體-性腺軸中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎動物的生殖神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中具有重要的作用.GnRH成熟的十肽沿著軸突被運(yùn)送到下丘腦正中隆起(median eminence)末端,然后進(jìn)入下丘腦垂體門脈循環(huán)(hypothalamo hypophyseal portal circulation)(四足動物)或直接通過軸突末梢(大多數(shù)硬骨魚)把信號傳遞給刺激性腺的細(xì)胞,與特異性受體結(jié)合,刺激促性腺激素(GtHs,gonadotropins)的合成與釋放,參與脊椎動物繁殖的起始和維持正常生殖功能.伴隨著GnRH的研究,研究者對魚類GnRH受體的研究也越來越感興趣,牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中國重要的海水養(yǎng)殖魚類,本研究從牙鲆腦組織中克隆得到全長的TypeⅠ GnRH受體,并對其組織特異性表達(dá)作了分析,為牙鲆的神經(jīng)生殖內(nèi)分泌研究奠定了一定的基礎(chǔ).在本研究中,以海水養(yǎng)殖牙鲆為材料,從牙鲆腦組織中采用巢式PCR、5'-和3'-RACE技術(shù)克隆得到了1 671 bp牙鲆促性腺激素釋放激素受體(GnRH-R)全長cDNA序列,包括147 bp的5'-UTR、1 248 bp的開放閱讀框和276 bp的3'-UTR,GenBank登錄號是DQ011872.牙鲆GnRH-R和其他物種GnRH-R的氨基酸序列的多序列比對結(jié)果顯示,其存在許多保守的特征,牙鲆GnRH-R顯示有3個(gè)主要的功能區(qū)域:1個(gè)N端胞外結(jié)構(gòu)域(1～44個(gè)氨基酸殘基)、1個(gè)大的跨膜結(jié)構(gòu)域(45～324個(gè)氨基酸殘基)和1個(gè)C端細(xì)胞質(zhì)區(qū)域(325～415個(gè)氨基酸殘基).空間結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示牙鲆GnRH-R跨膜區(qū)域包含7個(gè)高度保守的跨膜α螺旋(45-64、76-95、114-135、156-176、207-224、267-286、305-324),這些α螺旋是受體錨定到細(xì)胞膜上必需的.氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,牙鲆GnRH-R與琥珀魚GnRH-R1具有高度同源性(85%同源性).已知的硬骨魚GnRH-R基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,存在兩種類型的GnRH-R基因:Type Ⅰ GnRH-R和TpyeⅡGnRH-R基因.在牙鲆GnRH-R的氨基酸序列中,具有Type Ⅰ GnRH-R共有的典型基序:CAFVT(TM Ⅲ)和DLEGKVSHSLTH(TM Ⅶ開始的序列處),表明克隆得到的牙鲆GnRH-R屬于Type Ⅰ GnRH-R.GnRH-R跨膜α螺旋之間的區(qū)域形成了胞內(nèi)或胞外loops,這些區(qū)域參與受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和肽選擇性功能上.牙鲆GnRH-R在TMⅢ的細(xì)胞質(zhì)邊界處具有一個(gè)保守的DRQSAI(DRⅩⅩⅪ/Ⅴ)基序,這個(gè)基序被認(rèn)為參與G蛋白偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和GnRH肽誘導(dǎo)受體的激活;另一個(gè)保守的區(qū)域是位于TMⅦ內(nèi)的NPXXY或DPXXY基序同樣存在于牙鲆中(DPVIY),這個(gè)基序參與到一些GPCRs(包括GnRH-R)的內(nèi)在化(internalization),同時(shí)這個(gè)基序特別是基序中的Tyr殘基對于受體激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到關(guān)鍵作用.在第三個(gè)胞內(nèi)loop中,魚類GnRH-R有個(gè)保守的Ala殘基(在牙鲆中為Ala258),其也在G蛋白偶聯(lián)和受體內(nèi)在化方面具有重要作用.在哺乳動物或非哺乳動物GnRH-R中,在第一個(gè)和第二個(gè)胞外loop之間由2個(gè)Cys形成1個(gè)保守二硫橋,是受體的正確折疊必需的.和其他的GnRH-R一樣,牙鲆GnRH-R在第一個(gè)和第二個(gè)胞外loop之間存在由2個(gè)Cys(Cys112和Cys190)可以形成的潛在的二硫橋.這個(gè)二硫橋的完全缺失將會影響受體的結(jié)構(gòu)完整性和降低魚類GnRH-R對GnRH肽的選擇性.GnRH-Rs的NH2-末端區(qū)域不是很保守,但含有糖基化位點(diǎn),是GnRH-Rs表達(dá)、GnRH-Rs穿梭到細(xì)胞胞表面或受體穩(wěn)定必需的.將mouse的GnRH-R糖基化位點(diǎn)引進(jìn)到人GnRH-R中,可以增加受體的數(shù)量,但不影響受體結(jié)合力或肽選擇性[25-26].牙鲆Type Ⅰ GnRH-R中在NH2-末端含有3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(N11SSW、N15GSS和N22WTA),此外,在第一個(gè)胞外loop和第二個(gè)胞外loop中分別存在1個(gè)糖基化位點(diǎn)(N100ITV和N178VTI),牙鲆Type Ⅰ GnRH-R含有的糖基化位點(diǎn)比哺乳動物要多,牙鲆糖基化位點(diǎn)的數(shù)目是否/怎樣影響牙鲆GnRH-R的表達(dá)、降解率或親和力,應(yīng)該進(jìn)一步研究.在牙鲆GnRH-R的第一個(gè)胞內(nèi)loop中,存在1個(gè)和tGnRH-RⅢ基序(80KRKSH84)一致的基序(69KRKSH74),這個(gè)基序是Gs識別基序(BBXXB,B代表堿性氨基酸,X代表任何一種氨基酸).已經(jīng)證明這個(gè)基序和cAMP產(chǎn)生相關(guān),cGnRH-Ⅱ能通過cAMP-PKA途徑提高stbGnRH-R在COS7細(xì)胞中的活性.和其他非哺乳動物GnRH-Rs相似,牙鲆GnRH-R含有1個(gè)C-末端細(xì)胞內(nèi)尾巴.這種胞內(nèi)尾巴是魚類GnRH-Rs功能必需的,在第三個(gè)胞內(nèi)loop中,牙鲆GnRH-R含有2個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)(233SKR235和262TLK264);在C端尾巴中,存在1個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)(402TAR404).牙鲆GnRH-RC-末端尾巴中含有魚類GnRH-R具有的Src同源區(qū)3(SH3)結(jié)合區(qū)域(PxxP序列)(340PPAP),能夠潛在地傳送偶聯(lián)的能力到絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs),GnRH通過PKC和PKA調(diào)控GtHα和LHβ轉(zhuǎn)錄,二者都集中于MAPK水平.RT-PCR分析表明,GnRH-R在牙鲆腦和垂體有表達(dá),暗示牙鲆GnRH-R參與到生殖行為如產(chǎn)卵行為;RT-PCR也檢測到牙鲆GnRH-R在卵巢和睪丸中有表達(dá),其能與牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共表達(dá),GnRH肽在卵巢中具有自分泌/旁分泌功能,對牙鲆卵巢中的GnRH受體可能起到調(diào)控作用.

作 者： 房保海 鄭法新 孫修勤 曲凌云 張進(jìn)興 FANG Bao-hai ZHENG Fa-xin SUN Xiu-qin QU Ling-yun ZHANG Jin-xing   作者單位： 房保海,FANG Bao-hai(中國海洋大學(xué),生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東,青島,266003;國家海洋局第一海洋研究所,山東,青島,266061)

鄭法新,ZHENG Fa-xin(中國海洋大學(xué),生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東,青島,266003)

孫修勤,曲凌云,張進(jìn)興,SUN Xiu-qin,QU Ling-yun,ZHANG Jin-xing(國家海洋局第一海洋研究所,山東,青島,266061) 

刊 名： 中國水產(chǎn)科學(xué)  ISTIC PKU 英文刊名： JOURNAL OF FISHERY SCIENCES OF CHINA  年，卷(期)： 2006 13(4)  分類號： Q959.486  關(guān)鍵詞： 牙鲆   促性腺激素釋放激素   促性腺激素釋放激素受體   Paralichthys olivaceus   GnRH   GnRH receptor  

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