抑制性差減雜交技術(shù)在基因克隆中的運(yùn)用現(xiàn)狀論文
摘要：抑制性差減雜交技術(shù)是一種差異性基因克隆的新技術(shù)，它對研究細(xì)胞生殖、發(fā)育、分化、衰老及死亡等生命過程中有關(guān)基因的差異表達(dá)及相關(guān)基因的分子克隆提供了有力的技術(shù)工具。簡要概述了抑制性差減雜交技術(shù)的基本原理、優(yōu)越性、缺陷及其在相關(guān)基因克隆方面的應(yīng)用研究進(jìn)展。
關(guān)鍵詞：基因克��；抑制性差減雜交；應(yīng)用
生物體的生命過程伴有異常復(fù)雜的生物生化變化，是生物體內(nèi)相關(guān)基因的有序表達(dá)和調(diào)控的結(jié)果。對相關(guān)差異性表達(dá)基因進(jìn)行深入研究，能夠更加深入地了解生物體的生命活動規(guī)律。目前，分離差異性表達(dá)基因的主要技術(shù)為雜交技術(shù)（subtractive hybridization）和差示篩選技術(shù)（differential scre-ening），但這些技術(shù)存在重復(fù)性差、敏感度低等缺點(diǎn)。隨著現(xiàn)代 PCR 技術(shù)的發(fā)展，一系列基于 PCR 技術(shù)的分離差異性基因表達(dá)的新技術(shù)被開發(fā)出來。SSH技術(shù)就是一種利用抑制性 PCR 和以差減雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的一種簡單、快速地分離差異性表達(dá)基因的方法，該技術(shù)在研究基因克隆、基因表達(dá)及基因功能等方面有明顯的優(yōu)勢[1].筆者對使用 SSH 技術(shù)進(jìn)行研究的應(yīng)用現(xiàn)狀及其未來前景進(jìn)行了簡單介紹，旨在使 SSH 技術(shù)的應(yīng)用得到更加深入的認(rèn)識。
1SSH技術(shù)的過程及其優(yōu)缺點(diǎn)
1.1SSH技術(shù)的過程
SSH 研究應(yīng)用的材料可以是基因組 DNA,也可以是 c DNA,用于分離克隆 2 個樣品中特異基因或者是差異性表達(dá)的基因�；具^程是：抽提 2 種不同生物體的 DNA 或 c DNA;將經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后的 Tester DNA 分為 2 個部分，分別與 2 種接頭連接；再將這 2 個部分序列于過量酶切的 Driver DNA雜交，當(dāng)這 2 個部分 DNA 被最終混合雜交后，就允許了同源性的單鏈 DNA 分子雜交；通過 PCR 擴(kuò)增、克隆即可分析所差減的'序列。
1.2SSH技術(shù)具有的優(yōu)點(diǎn)[2]
高效高速。在一次 SSH 雜交試驗過程中，就可以同時分離出上百個差異性表達(dá)的基因。靈敏度高。在退火時，高豐度的單鏈 DNA 同源雜交的速度快于低豐度的單鏈 DNA,導(dǎo)致原來在豐度上有差別的單鏈 DNA 在相對含量上能夠達(dá)到一致，從而對于低豐度的基因也可以通過基因克隆表達(dá)出來。假陽性率低。經(jīng)過 2 次雜交和 2 次 PCR 擴(kuò)增選擇性地擴(kuò)增差異表達(dá)目的 DNA ，提高了特異基因的篩出率，使得假陽性率大大降低。簡單易行，對儀器設(shè)備要求不高。背景低、重復(fù)性高。
1.3SSH技術(shù)存在的不足[2]
基因組中酶切位點(diǎn)較少的不適用 SSH 技術(shù)；分離到的差異表達(dá)基因片段，還需要擴(kuò)增全長；起始材料相對要求較多，不適于來源困難的樣品；對試驗材料的要求較高，試驗材料間差異性要求較低。
2SSH技術(shù)的應(yīng)用
2.1SSH技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用
孫守娟等[3]采用 SSH 技術(shù) ,構(gòu)建了舌鱗癌 Tca8113 細(xì)胞系中高、低醛脫氫酶活性細(xì)胞差異表達(dá)基因 c DNA 文庫，用 Trizol 分別提取 2 個細(xì)胞的總RNA;用 SSH 技術(shù)對 2 組 RNA 進(jìn)行差異基因篩選和擴(kuò)增，克隆片段均勻分布在 250~750 bp,無假陽性克隆。測序結(jié)果經(jīng)同源性比對分析可知 ,與腫瘤有關(guān)的基因有SLC25,A13 NPC1,KLHL2,BARD1,WAPL,Notch2,EEF2K.車紅花等[4]通過 SSH 技術(shù)，克隆了受病毒攻擊的宿主細(xì)胞中被中藥有效成分調(diào)控的基因，結(jié)果顯示，核糖體蛋白 L27a 在中藥組中高表達(dá)，病毒組中表達(dá)減弱或被抑制；益氣活血中藥復(fù)方能夠影響受 CVB3 攻擊的宿主細(xì)胞核糖體蛋白 L27a 的表達(dá)，有效保護(hù)心肌、阻斷病程進(jìn)度，實(shí)現(xiàn)治療病毒性心肌炎的目的。
李守明等[5]采用抑制性差減雜交技術(shù)，鑒定母鼠鉛暴露后代海馬差異表達(dá)基因，構(gòu)建了一個近200 個克隆的差減基因文庫，得到 93 個有效克隆，從中克隆和鑒定了母鼠鉛暴露致使學(xué)習(xí)和記憶能力顯著下降的幼鼠中海馬差異表達(dá)的基因，共 43種不同的基因以及 4 種未知功能基因。這些基因包括一些看家基因和一些與細(xì)胞蛋白折疊、信號傳導(dǎo)、應(yīng)激響應(yīng)及 DNA 甲基化相關(guān)功能的基因。
2.2SSH技術(shù)在植物學(xué)上的應(yīng)用
劉蕾等[6]應(yīng)用 SSH 篩選植物青枯菌致病相關(guān)基因，研究該菌株致病力分化機(jī)理，以 Po82 為待測菌株，構(gòu)建了抑制性差減雜交文庫，結(jié)果表明，具有較高的接頭連接以及文庫構(gòu)建效率，插入片段平均長度為 300 bp,文庫構(gòu)建質(zhì)量較好。對文庫中隨機(jī)挑取陽性克隆進(jìn)行測序，共篩選出 44 個 Po82 菌株差異基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，所得差異基因主要涉及新陳代謝、膜結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)坐酶、毒力、分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及未知功能等。閔卓等[7]以赤霞珠葡萄新梢上冬芽和夏芽為材料（夏芽作為驅(qū)動方，冬芽作為試驗方），采用 SSH 技術(shù)構(gòu)建冬芽和夏芽的c DNA 文庫，篩選冬芽和夏芽差異表達(dá)的基因片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一些在冬芽中表達(dá)頻率較高的基因，如編碼 MADS FLC-like 蛋白、鈣依賴蛋白激酶、NADP依賴型的蘋果酸酶、細(xì)胞壁水解酶、細(xì)胞壁松弛蛋白、外被體蛋白β亞基、熱激蛋白、衰老相關(guān)蛋白、細(xì)胞色素 P450、細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白等基因；同時還認(rèn)為，線粒體蛋白基因、開花相關(guān)基因、未知蛋白基因、ATP 合成酶β亞基基因、MADs FLC-like 蛋白基因等與葡萄芽生理休眠具有相關(guān)性。葉曉明等[8]以溫敏雄性不育系 K121S 在可育溫度 10℃下和不育溫度 26℃下三核期花蕾為材料，以可育溫度下的c DNA 為驅(qū)動子，采用 SSH 技術(shù)構(gòu)建了不育溫度下SSH 文庫，隨機(jī)挑選 97 個陽性菌落測序，得到 20個表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），包括與 ATP 合成酶β亞基、Rubp 羧化酶小亞基同源的 EST 等，為進(jìn)一步獲得育性轉(zhuǎn)換相關(guān)基因和揭示 K121S 的育性轉(zhuǎn)換分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
2.3SSH技術(shù)在微生物學(xué)上的應(yīng)用
李淼等[9]采用 SSH 技術(shù)尋找副豬嗜血桿菌的毒力基因，以無毒力菌株 H465 和有毒力菌株 SW124為材料，構(gòu)建了 SSH 文庫，使用 Southern 雜交和PCR 鑒定對差異基因片段進(jìn)行篩選結(jié)果顯示，從構(gòu)建的文庫中得到 7 個特異性差異基因片段，其中，2個差異基因片段與功能未知蛋白基因有關(guān)，5 個片段分別與膜多糖磷酸酶 / 糖基轉(zhuǎn)移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、莢核糖體蛋白丙氨酸、轉(zhuǎn)移酶噬菌體重組蛋白和 ABC 型硝酸鹽，碳酸氫鹽 / 磺酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)周質(zhì)蛋白等編碼的基因有同源性。
祝昊丹[10]采用 SSH 技術(shù)將無毒株 SH040917SS9與強(qiáng)毒株 SH040917 進(jìn)行雜交，共獲得 61 個毒力特異的基因片段，結(jié)果表明，這些片段與 30 種不同的蛋白編碼基因具有同源性，包括類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶、DNA 核酸酶、溶血素相關(guān)蛋白酶、蘇氨酸磷酸化蛋白酶等。
戴建君[11]采用 SSH 技術(shù)對禽致病性大腸桿菌菌株和人尿源性大腸桿菌差異性表達(dá)基因序列進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 28 個新毒力基因片段，并對這些基因片段流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)大部分新的毒力基因與流行病學(xué)有較大的相關(guān)性。
2.4SSH技術(shù)在動物學(xué)上的應(yīng)用曲
憲成等[12]應(yīng)用 SSH 技術(shù)構(gòu)建了黃鱔 IV 期卵巢和間期性腺的差減 c DNA 文庫，正向差減雜交以間期性腺為試驗方，IV 期卵巢為驅(qū)動方；反向差減雜交以 IV 期卵巢為試驗方，間期性腺為驅(qū)動方，將獲得的差減 c DNA連接質(zhì)粒載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，最后獲得的正、反向差減文庫分別含461,678 個重組子。經(jīng) PCR 擴(kuò)增鑒定，插入片段范圍為 200~2 000 bp.隨機(jī)選取正、反文庫共 100 個陽性克隆測序分析，得到 90 個有效基因片段，與Gen Bank 進(jìn)行 BLASTx 和 BLASTn 同源比對，進(jìn)一步從文庫中選取 2 個基因用于半定量 RT-PCR,對文庫質(zhì)量進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，所建文庫能夠達(dá)到富集 IV 期性腺差異表達(dá)基因的目的。黃鱔性腺差減文庫的構(gòu)建，為進(jìn)一步分離、鑒定黃鱔性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)的相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。
李超等[13]利用 SSH 技術(shù)，以鏈球菌疫苗免疫前后羅非魚白細(xì)胞 c DNA 為材料，構(gòu)建了羅非魚免疫前后正、負(fù) 2 個 c DNA 差減文庫，并采用地高辛（DIG）標(biāo)記差減文庫 c DNA 作為探針，進(jìn)行差異表達(dá)片段的篩選鑒定，結(jié)果顯示，2 個文庫重組率均在90%以上，插入片段在 300~900 bp,接頭連接效率超過 50%,差減效率非常高，陽性率均超過 70%.雜交篩選后，對正、負(fù)文庫各挑選 30 個陽性克隆進(jìn)行測序組裝聚類，正、負(fù)文庫分別獲得 16,18 條 EST,所得序列經(jīng) Gen Bank 同源性分析，正、負(fù)文庫分別有 10,11 條 EST 獲得功能注釋，且分別有 6,7 條unigene 沒有同源性匹配，定為未知新基因。
劉晶等[14]采用 SSH 技術(shù)，研究營養(yǎng)素對皺紋盤鮑基因表達(dá)的影響，對構(gòu)建的文庫中 48 個克隆進(jìn)行了測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 32 個已知功能基因和 16 個新基因。王嘉等[15]采用 SSH 技術(shù)研究皺紋盤鮑 Vc缺乏誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因，共獲得了 63 個基因片段，其中，已知功能基因有 34 個；在 c DNA 文庫中獲得 39個片段，其中，已知功能基因有 21 個，包括細(xì)胞代謝、生物調(diào)節(jié)等相關(guān)基因。
另外，梅冰[16]利用 SSH 技術(shù)對溶藻弧菌的毒力相關(guān)基因進(jìn)行篩選和鑒定研究，構(gòu)建溶藻弧菌毒力菌株 SSH 文庫，結(jié)果顯示，所構(gòu)建的溶藻弧菌毒力菌株的 SSH 文庫含有 8 個已知的常見毒力相關(guān)功能基因，該文庫還含有 166 個未知新基因，占文庫中總基因數(shù)的 68.44%,溶藻弧菌的毒力基因很可能存在于這些未知新基因中。說明構(gòu)建的 SSH 文庫中 166 個未知新基因很有可能包含有溶藻弧菌的關(guān)鍵毒力基因，為溶藻弧菌毒力基因的鑒定和今后開展溶藻弧菌基因工程疫苗的研制奠定了重要的基礎(chǔ)。
3展望
在現(xiàn)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中，差異基因的篩選和鑒定已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。SSH 技術(shù)操作簡單、所需試驗儀器廉價、試驗過程簡單、陽性率高，分離差異基因提供了一種強(qiáng)有力的工具。隨著 SSH 技術(shù)的不斷改進(jìn)，在生物研究的各個領(lǐng)域，如微生物學(xué)、動物學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了大力的推廣。在未來的發(fā)展中，SSH 將與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，各取所長，為研究差異基因的表達(dá)提供新的技術(shù)手段。
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