關(guān)于吞噬細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸外翻的關(guān)系的論文
引言
作為天然免疫的重要組成部分, 血清調(diào)理素(serum opsonin)-包括補體和抗體-能夠有效地促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用, 此即調(diào)理作用(opsonization). 有研究表明, 一些吞噬細(xì)胞只有在血清存在的情況下, 才能發(fā)揮吞噬作用, 這種現(xiàn)象稱之為血清依賴的調(diào)理作用.一般來說, 調(diào)理作用的目的是清除一些被調(diào)理(opsonized)的顆粒性抗原, 這一過程通常是由吞噬細(xì)胞膜表面的特異性受體介導(dǎo)的, 如FcR、CR1等. 目前發(fā)現(xiàn)血清中能夠發(fā)揮調(diào)理作用的分子還有很多, 如血小板反應(yīng)蛋白Ⅰ、β2糖蛋白Ⅰ、C反應(yīng)蛋白、DNA酶Ⅰ等等, 而這些分子是否借助特定的膜受體發(fā)揮調(diào)理作用、通過哪些受體發(fā)揮作用、是否還有其他影響調(diào)理作用的機制等很多問題目前還不清楚, 因此有必要對血清依賴的調(diào)理作用的機制進(jìn)行進(jìn)一步的研究.磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)是細(xì)胞膜的一種成分, 通常位于細(xì)胞膜的內(nèi)層, 在細(xì)胞發(fā)生凋亡的時候, 細(xì)胞膜的這種不對稱性發(fā)生了破壞, 導(dǎo)致PS的外翻(inside-to-outsidemovement or flop). 然而, PS外翻并不總是意味著細(xì)胞的凋亡, 如單核細(xì)胞來源的吞噬細(xì)胞表面就組成型的表達(dá)PS, 并且有研究表明這種PS外翻與其特定的吞噬功能密切相關(guān). 如果封閉其表面的PS, 單核吞噬細(xì)胞吞噬凋亡胸腺細(xì)胞的活性顯著下降, 但是對其他受體介導(dǎo)的吞噬活性并無抑制作用, 因此表面外翻的PS是單核吞噬細(xì)胞特定清除凋亡細(xì)胞所必需的. 然而, 目前對于單核吞噬細(xì)胞表面PS外翻的機制有不同的看法, 有人認(rèn)為由凋亡細(xì)胞上脫落下來的囊泡被吞噬細(xì)胞攝取后將外翻的PS傳遞給了后者. 還有人認(rèn)為是PS轉(zhuǎn)運蛋白將PS從胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運到了外側(cè), 或者是膜的不對稱性在單核吞噬細(xì)胞中與其他細(xì)胞有所不同. 因此導(dǎo)致單核細(xì)胞表面PS外翻的機制仍然是不清楚的.眾所周知, 細(xì)胞所處的微環(huán)境對于細(xì)胞發(fā)揮生理功能具有重要的影響, 單核吞噬細(xì)胞在體內(nèi)通常處于血清所組成的微環(huán)境中, 因此我們考慮吞噬細(xì)胞的PS外翻與血清依賴的調(diào)理作用之間是否存在某種聯(lián)系呢? 在本文中我們對這一問題進(jìn)行了研究.在本研究中, 我們通過Annexin V染色來示蹤PS. 結(jié)果顯示外周血單核細(xì)胞(peripheralblood mononuclear cells, PBMC)在體外剛分離出來時, PS外翻的細(xì)胞比例很低, 但是在經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后再進(jìn)行檢測時, 這群細(xì)胞的比例顯著升高, 這種PS外翻的現(xiàn)象在接觸血清后的很短時間內(nèi)(1 h內(nèi))就能檢測到. 通過流式表型分析, 這群細(xì)胞大多是MHC-Ⅱ+的, 證明其確是PBMC中的單核吞噬細(xì)胞. 我們對細(xì)胞的吞噬能力進(jìn)行了檢測, 結(jié)果表明在血清誘導(dǎo)的PS外翻的前提下, 加入能與PS特異性結(jié)合的Annexin V, 能夠顯著地增加細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力, 因此我們的研究表明, 血清能夠誘導(dǎo)PBMC的胞膜PS外翻, 并且外翻的PS參與了對細(xì)菌的調(diào)理作用.
1 材料和方法
1.1 材料
人外周血來自于實驗室志愿者, 經(jīng)肝素鈉抗凝管采集. 表達(dá)綠色熒光蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli , E. coli )由華南理工大學(xué)藍(lán)東明副教授惠贈. Annexin V-FITC ApoptosisDetection Kit Ⅰ購自美國BD公司; 細(xì)胞脂質(zhì)丙二醛(malondialdehyde, MDA)活性TBARS光度法定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司; anti-CD3, anti-CD56和anti-HLADR單克隆抗體購自美國Beckman Coulter公司;Ficoll-paque分離液購自美國GE公司; RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Life公司.
1.2 方法
1.2.1 PBMC的分離:
健康人外周血經(jīng)抗凝管采集后, 用等量的生理鹽水進(jìn)行稀釋, 稀釋后的外周血小心鋪加于含適量Ficoll-paque淋巴細(xì)胞分離液的液面上, 隨后按要求進(jìn)行離心、吸取和洗滌, 洗滌后的PBMC或進(jìn)行流式檢測或重懸于相應(yīng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行后續(xù)實驗.
1.2.2 PBMC的體外處理:
長時間培養(yǎng): 新鮮分離的PBMC或者立即上機檢測, 或者重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中, 同時加入終濃度為1000 IU/mL的IL-2, 以及100 IU/mL的氨芐青霉素和50 μg/mL的鏈霉素, 每3 d進(jìn)行半量換液, 在培養(yǎng)的3 d和7 d分別進(jìn)行相應(yīng)的檢測.短期處理: 新鮮分離的PBMC重懸于含有或者不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中, 于37 ℃ 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)1 h, 然后收集細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的檢測.
1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記檢測:
取1×106個細(xì)胞, 收集于1.5 mL離心管中, 400 g 離心8 min, 棄上清液, 用預(yù)冷的PBS洗滌2次, 重懸于100 μL binding buffer中. 避光加入2.5 μLAnnexin V-FITC和5 μL PI于細(xì)胞懸液中, 輕輕混勻. 常溫避光染色15 min. 再加入400 μLbinding buffer混懸細(xì)胞, 轉(zhuǎn)移至流式管, 1 h內(nèi)進(jìn)行流式分析.
1.2.4 TBARS光度法脂質(zhì)過氧化檢測:
取2×107個細(xì)胞, 參照Genmed公司脂質(zhì)過氧化檢測試劑盒的檢測方法, 提取總蛋白, BCA法測定總蛋白濃度, 并調(diào)節(jié)蛋白濃度一致(在20-50 mg/mL范圍內(nèi)), 酶標(biāo)儀檢測MDA的吸光值.
1.2.5 流式抗體與Annexin V-FITC共染:
取1×106個細(xì)胞, PBS洗滌、重懸后加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體, 避光染色20 min后用預(yù)冷的PBS洗滌2次, 重懸于100 μL binding buffer中,按上述方法加入Annexin V-FITC進(jìn)行染色, 1 h內(nèi)進(jìn)行流式分析.1.2.6 PBMC的吞噬效率檢測: 利用4%甲醛對綠色熒光蛋白細(xì)菌進(jìn)行固定, 經(jīng)PBS洗滌后, 取100 μL菌液加入各組PBMC細(xì)胞, 于37 ℃ 50mL/L CO2條件下培養(yǎng)30 min后, 利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的吞噬效率, 將FS閾值設(shè)為100, 以去除游離細(xì)菌的干擾.
1.3統(tǒng)計學(xué)處理
本實驗相關(guān)數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析, 相關(guān)數(shù)據(jù)以mean±SD表示, 采用單因素方差分析比較各組差異. 當(dāng)P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.
2 結(jié)果
2.1 PBMC體外培養(yǎng)前后PS+細(xì)胞比例的變化
利用Ficoll-paque從外周血中分離PBMC, 經(jīng)生理鹽水洗滌后, 一部分進(jìn)行Annexin V/PI染色, 并進(jìn)行流式檢測. 其余部分重懸于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中, 于37 ℃, 50mL/L CO2條件下培養(yǎng), 分別在培養(yǎng)的3 d和7 d收集細(xì)胞, 利用流式檢測Annexin V/PI的染色情況. 結(jié)果顯示, 培養(yǎng)后的PBMC其Annexin V染色陽性比例有顯著的增加, 剛分離時PBMC中Annexin V+細(xì)胞比例為2%左右,在培養(yǎng)至第3天時, 這一比例超過了6%, 第7天時仍略有上升. 但是增加的Annexin V單陽性的這部分細(xì)胞并沒有隨著時間的增加而進(jìn)入Annexin V/PI雙陽性象限, 第7天和第3天時Annexin V+/PI+差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 從而證明Annexin V單陽性的這部分細(xì)胞并不是處于早期凋亡狀態(tài)的細(xì)胞, 而只是發(fā)生了PS外翻.
2.2 經(jīng)過短暫的血清處理后PS+細(xì)胞的變化
取新鮮分離的PBMC樣本, 經(jīng)生理鹽水洗滌后, 分別用含有或者不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸, 于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)1 h后, 收集細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式檢測. 結(jié)果顯示, 含血清培養(yǎng)基處理的PBMC其Annexin V+細(xì)胞比例顯著高于不含血清培養(yǎng)基處理組, 且具有顯著性差異(P<0.05), 而PI染色陽性細(xì)胞在處理前后并沒有顯著差異.這表明血清處理能夠顯著促使PBMC胞膜的PS外翻.
2.3 不同培養(yǎng)條件下MDA的含量檢測
有研究指出, Annexin V除了能與PS結(jié)合外, 還能夠與細(xì)胞膜中的一些脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物, 如MDA結(jié)合]. 因此為了排除Annexin V染色是由于PBMC胞膜中的MDA增加造成的, 我們對各組PBMC中的MDA含量進(jìn)行了檢測, 以H2O2處理組作為陽性對照. 結(jié)果表明, 含血清培養(yǎng)基處理的PBMC胞膜MDA含量與不含血清培養(yǎng)基處理的PBMC組沒有顯著差異, 但是兩者均與H2O2處理組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 這表明PBMC中Annexin V染色陽性確實是由于PS外翻造成的.
2.4 PBMC中PS+細(xì)胞的表型
由于PBMC中含有不同類型的細(xì)胞, 我們又對不同類型細(xì)胞表面PS外翻的情況進(jìn)行了檢測. 結(jié)果顯示, 在檢測的幾種PBMC細(xì)胞中, 血清處理后annexin V+細(xì)胞中只有HLA-DR+細(xì)胞的PS外翻顯著增加, 其他幾種細(xì)胞的比例都是下降的, 且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05). 這表明PBMC中的單核吞噬細(xì)胞是對血清處理敏感的主要細(xì)胞亞群, 血清接觸是促使其PS外翻的重要條件.
2.5 PS外翻對細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力的影響
為了闡明外翻的PS是否能夠影響細(xì)胞的吞噬作用,我們對血清處理前后PBMC吞噬綠色熒光蛋白細(xì)菌的`能力進(jìn)行了檢測. 結(jié)果表明, 未經(jīng)血清處理的PBMC其吞噬能力非常低, 只有1%左右的細(xì)胞具有吞噬能力; 經(jīng)過血清處理后,吞噬細(xì)胞的比例超過了9%; 而利用PS特異性的配體Annexin V與血清一起處理PBMC, 則吞噬細(xì)胞的比例增加到了12%左右, 并且未經(jīng)血清處理組與其他兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 其他兩組之間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05). 這一結(jié)果表明, 外翻的PS參與了吞噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬作用.
3 討論
大部分的細(xì)胞其氨基磷脂都是分布在細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè), 這是一個耗能的過程, 表明這種分布對于正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要. 然而部分類型的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、血小板、B淋巴細(xì)胞、成肌細(xì)胞等, 在正常生理狀態(tài)下, 其PS組成型的位于胞膜外側(cè), 表明暴露的PS對于這些細(xì)胞的功能和分化非常重要.
有研究表明, PS外翻對于吞噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬凋亡細(xì)胞的功能具有促進(jìn)作用, 但是對于Fc受體介導(dǎo)的對紅細(xì)胞的吞噬作用沒有影響. 然而如前所述, 對于吞噬細(xì)胞PS外翻的機制, 目前還沒有統(tǒng)一的看法. 而吞噬細(xì)胞血清依賴的調(diào)理作用這一現(xiàn)象, 使得我們認(rèn)識到有必要對血清處理和PS外翻之間的聯(lián)系進(jìn)行研究.
我們的結(jié)果顯示, 體外新鮮分離的PBMC在接觸血清之前, 其PS+細(xì)胞比例很低, 一旦接觸血清, PS+細(xì)胞的比例很快有顯著性的升高. 結(jié)合細(xì)胞表型分析, 升高的PS+細(xì)胞主要是HLA-DR+的, 表明血清接觸主要促進(jìn)PBMC中單核吞噬細(xì)胞的PS外翻. 短暫的接觸就能誘導(dǎo)顯著的PS外翻, 并且發(fā)生在沒有外來凋亡細(xì)胞存在的情況下, 這一結(jié)果排除了吞噬細(xì)胞攝取凋亡細(xì)胞脫落的囊泡從而導(dǎo)致其PS顯露在胞外的可能性. 同時由于這種PS外翻發(fā)生的時間較短(可以發(fā)生在1 h甚至更短的時間內(nèi)), 不太可能依賴于某些基因表達(dá)的變化, 因此這也表明, 是血清中的某種特定成分直接誘導(dǎo)或者通過細(xì)胞膜上的PS轉(zhuǎn)運蛋白導(dǎo)致單核吞噬細(xì)胞發(fā)生了PS的外翻. 此外, 針對細(xì)菌的吞噬能力檢測顯示, 血清誘導(dǎo)的PS外翻參與了吞噬細(xì)胞對細(xì)菌的調(diào)理作用, 這表明血清調(diào)理作用, 不僅可以通過FcR和補體受體等分子發(fā)揮作用, 也可以通過PS發(fā)揮作用.
至于血清中的何種成分誘導(dǎo)了單核吞噬細(xì)胞的PS外翻, 血清誘導(dǎo)的PS外翻是否需要細(xì)胞膜中PS轉(zhuǎn)運蛋白的參與以及何種轉(zhuǎn)運蛋白的參與, 這種表型變化對其功能有何意義, 這些問題都有待進(jìn)一步的深入研究.
總之, 本研究表明吞噬細(xì)胞PS外翻是血清依賴的, 并且這種外翻的PS參與了對細(xì)菌的調(diào)理作用, 這一結(jié)果為揭示吞噬細(xì)胞PS外翻的機制提供了思路.
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