水浴加熱后微囊藻的數(shù)量統(tǒng)計(jì)方法的論文
0 前言
微囊藻屬 Microcystis 隸屬于藍(lán)藻門 Cyanophyta、色球藻目 Oococcales、微囊藻科 Microcystaceae,群體微小或大型自由漂浮[1].微囊藻適應(yīng)溫度為 25℃ ~30℃，PH 為 8. 0 ~9. 5 的水域生長(zhǎng)，在環(huán)境條件適合其生長(zhǎng)時(shí)會(huì)大規(guī)模繁殖形成水華[2].水華微囊藻問題在國(guó)內(nèi)日益嚴(yán)重，就磁湖而言，每年夏季都會(huì)爆發(fā)大規(guī)模微囊藻水華。微囊藻水華爆發(fā)不僅會(huì)對(duì)湖泊生態(tài)系統(tǒng)帶來嚴(yán)重的危害[3],而且嚴(yán)重影響人們的生產(chǎn)生活。水華微囊藻散發(fā)出的刺鼻氣味會(huì)影響周邊居民的正常生活，同時(shí)有毒微囊藻水華產(chǎn)生的毒素將影響人類的生產(chǎn)生活用水[4 ~5].
微囊藻在自然水體中極易聚集成群生長(zhǎng)，并且組成群體的微囊藻是隨機(jī)的，數(shù)量不等，不同群體的大小差異巨大[6],造成了微囊藻計(jì)數(shù)困難�，F(xiàn)在常用于的藻類計(jì)數(shù)方法---直接鏡檢法[7],由于微囊藻群體的影響，以個(gè)體計(jì)數(shù)法和群體計(jì)數(shù)法都會(huì)使得計(jì)數(shù)存在很大的隨機(jī)性，不能科學(xué)快速地計(jì)數(shù)出微囊藻數(shù)量。一定頻率的超聲波能使微囊藻群體解體成小群體，因此，現(xiàn)在也有使用以一定頻率的超聲波處理一段時(shí)間后再使用直接鏡檢法計(jì)數(shù)[8],但微囊藻處理會(huì)造成細(xì)胞不同程度的損失，對(duì)計(jì)數(shù)帶來誤差[8,9 ~12].其他方法包括電子微粒計(jì)數(shù)法，流式細(xì)胞儀，圖像分析法，回歸方程計(jì)數(shù)法，TiO2等，都有一定的局限性[9 ~11,13].
在一些研究中發(fā)現(xiàn)，加熱使得微囊藻群體解散成為單個(gè)的微囊藻，并不會(huì)對(duì)微囊藻細(xì)胞造成損失[9 ~12].本實(shí)驗(yàn)利用這一特性，用水浴加熱的方法對(duì)微囊藻進(jìn)行處理，使微囊藻細(xì)胞群體解體成單細(xì)胞或小群體，方便計(jì)數(shù)，提高微囊藻計(jì)數(shù)的精確性。
1 實(shí)驗(yàn)材料及方法
1. 1 實(shí)驗(yàn)材料采集地點(diǎn)及時(shí)間
實(shí)驗(yàn)材料取于五一湖水下 0. 4m 的水樣，取材時(shí)間為 8 月份水華爆發(fā)時(shí)間，主要藻種為藍(lán)藻門水華微囊藻和銅綠微囊藻。由于采集時(shí)間為水華爆發(fā)時(shí)間，水樣中藻細(xì)胞密度過大，將采集的水樣以稀釋后水樣在不同溫度梯度下水浴加熱 5min. 用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡（外接成像系統(tǒng)） 40 倍鏡下計(jì)量單個(gè)群體的最大投影面積以及計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)的群體數(shù)量，同時(shí)記錄單個(gè)細(xì)胞的數(shù)量。采集時(shí)溫為 30℃，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃ 5 個(gè)溫度梯度，每個(gè)梯度做 5 個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣做4 個(gè)裝片進(jìn)行觀察取平均值。
1. 3 密度計(jì)算
密度計(jì)算公式為 N = Vs·n/Va式中 N 為 1L 水中浮游植物密度（個(gè)/L） ; Vs 為定量體積取 1L; n 為計(jì)數(shù)體積觀察的個(gè)數(shù)； Va 為計(jì)數(shù)體積。
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
2. 1 群落的解體及藻單細(xì)胞數(shù)量變化
微囊藻群體在經(jīng)過水浴五分鐘處理后，藻液在 30℃ ~70℃之間的溫度梯度下單細(xì)胞數(shù)量如圖 1所示。細(xì)胞群體數(shù)量與大小數(shù)量變化如圖 2 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： 從 30℃開始，微囊藻單細(xì)胞數(shù)量隨著溫度的`升高而增多，30℃的單個(gè)細(xì)胞數(shù)量 3.
15 × 1011個(gè)/L,到 60℃達(dá)到 139. 2 ×1011個(gè)/L. 溫度達(dá)到 60℃后，群體已經(jīng)基本消失，再繼續(xù)升溫，藻細(xì)胞的數(shù)量不再增加，溫度過高甚至?xí)䦟?dǎo)致微囊藻單細(xì)胞解體，藻細(xì)胞數(shù)量減少。因此，微囊藻群體的最適解體溫度在 60℃左右。在 60℃左右時(shí)，群體已基本解體，微囊藻以單細(xì)胞的形式存在，數(shù)量基本固定，繼續(xù)升溫反而會(huì)導(dǎo)致微囊藻細(xì)胞的損失，造成計(jì)數(shù)的誤差。
圖 2 所示為微囊藻群體最大投影面積在不同溫度下的變化趨勢(shì)。在溫度為 30℃時(shí)，微囊藻群體最大投影面積達(dá)到 12500μm2,群體大小沒有規(guī)律，不同大小的群體均存在。當(dāng)溫度達(dá)到 50℃時(shí)，微囊藻群大小主要集中在 500 ~2500μm2范圍內(nèi)，并且群體數(shù)量呈下降趨勢(shì)。溫度 60℃以后，群體數(shù)量繼續(xù)減少，而且沒有面積超過 2500μm2的大群體。與之對(duì)應(yīng)的微囊藻單細(xì)胞數(shù)量隨著溫度的升高在逐漸的增多（圖 1） .隨著溫度的升高，微囊藻的群體越來越小，大群體數(shù)量變少，溫度達(dá)到 70℃時(shí)微囊藻群體群體全部解體為單個(gè)藻細(xì)胞，并且微囊藻單細(xì)胞也開始解體，細(xì)胞密度隨之減少。
2. 2 處理前后對(duì)比
微囊藻經(jīng)過水浴處理后，微囊藻群體大小以及單細(xì)胞數(shù)量有明顯的變化，有部分沒有完全分散成單細(xì)胞的微囊藻群體在水浴后由處理前的多層細(xì)胞變?yōu)閱螌蛹?xì)胞，給計(jì)數(shù)帶來了極大的方便。
對(duì)微囊藻水浴加熱后，以傳統(tǒng)的鏡檢法計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示： 在一定溫度（60℃） 內(nèi)，微囊藻計(jì)數(shù)相對(duì)偏差隨著溫度的逐漸升高而減小，微囊藻的計(jì)數(shù)誤差在隨著水浴溫度的升高而降低，當(dāng)溫度達(dá)到60℃ 以上時(shí)，計(jì)數(shù)的誤差又開始增加，這是由于溫度升高后，微囊藻的單細(xì)胞開始解體，計(jì)數(shù)結(jié)果比實(shí)際結(jié)果偏低，造成計(jì)數(shù)上的誤差。
3 結(jié)論
經(jīng)過水浴處理后的微囊藻基本都由大群體解體成為可計(jì)數(shù)的小群體，而小的群體則直接解體成為單細(xì)胞。因此，在一定的范圍內(nèi)微囊藻群體隨著溫度的升高解體的越徹底，微囊藻藻液的均勻度在溫度升高過程中逐漸升高，微囊藻的計(jì)數(shù)在水浴加熱后變得更加準(zhǔn)確。這一方法的實(shí)現(xiàn)，突破了以前超聲波，OD - 密度法以及直接鏡檢法等其他方法的一些局限性，為微囊藻計(jì)數(shù)帶來一種新的方法，提高了微囊藻計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率，并且該方法操作簡(jiǎn)單，使用要求低，是一種比較好的方法。在此方法上需要進(jìn)一步確定更為細(xì)小的溫度梯度以及更準(zhǔn)確的水浴時(shí)長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)更為精確的計(jì)數(shù)。同時(shí)需要對(duì)更多的微囊藻種類的最佳水浴溫度進(jìn)行試驗(yàn)，使該方法能更廣泛地適用于微囊藻計(jì)數(shù)。
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