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小鼠骨髓的綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

時(shí)間:2024-08-05 08:52:18 報(bào)告 我要投稿
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小鼠骨髓的綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

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小鼠骨髓的綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

  本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

  學(xué)號

  姓名

  學(xué)院

  專業(yè)、班級

  實(shí)驗(yàn)課程名稱:

  教師及職稱

  開課學(xué)期

  至

  學(xué)年

  學(xué)期

  填報(bào)時(shí)間×年×月×日

  云南師范大學(xué)教務(wù)處編印

  實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

  實(shí)驗(yàn)序號

  實(shí)驗(yàn)名稱

  實(shí)驗(yàn)時(shí)間

  實(shí)驗(yàn)室

  一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

  1、學(xué)習(xí)并掌握小鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備方法。

  2、觀察小鼠染色體的形態(tài)特征,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的染色體數(shù)目。

  3、了解微核發(fā)生的機(jī)制;

  4、掌握微核實(shí)驗(yàn)的一般程序和實(shí)踐意義;

  5、掌握對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行藥物處理的一般程序;

  6、掌握進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般程序和規(guī)則,并鍛煉實(shí)踐能力。

  二、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖

  1、骨髓細(xì)胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期細(xì)胞而不必象血淋巴細(xì)胞或組織那樣要經(jīng)過體外培養(yǎng)。經(jīng)秋水仙素處理后,分裂增殖中的骨髓細(xì)胞由于紡綞體的形成受到抑制,染色體不能正常趨向兩極而使之停留于中期,同時(shí)染色體縮短,輪廓清晰,把收獲的細(xì)胞進(jìn)行低滲,固定處理,使細(xì)胞處于膨脹狀態(tài),再將細(xì)胞懸液滴在載片上,使細(xì)胞破裂,染色體散開,染色后即可觀察到染色體。

  2、微核(Micronucleus):染色單體或染色體的無著絲點(diǎn)斷片,或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體,在細(xì)胞分裂后期,仍然遺留在細(xì)胞質(zhì)中。末期之后,單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核,被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),因比主核小,故稱為微核。凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)物,都可用微核試驗(yàn)來檢測。各種類型的骨髓細(xì)胞都可形成微核,但有核細(xì)胞的胞質(zhì)少,微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。

  嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個(gè)階段,此時(shí)紅細(xì)胞的主核已排出,因胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體,姬姆薩染色呈灰藍(lán)色,成熟紅細(xì)胞的核糖體已消失,被染成淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足,微核容易辨認(rèn),而且微核自發(fā)率低,因此,骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。

  三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料

  1、材料:小白鼠(2n=40)

  2、器具:注射器(1ml,5ml各一支)、托盤、解剖剪、鑷子、吸管、離心管、離心機(jī)、載片、濾紙、白紗布小塊等。

  3、藥品:0.15mg/ml秋水仙素,1%檸檬酸三鈉,固定液(3份甲醇,1份冰乙酸,臨用時(shí)現(xiàn)配),Giemsa染液,2.2%檸檬酸鈉,0.01M磷酸緩沖液(PBS)pH6.8。

  4、生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、注射器、載玻片、蓋玻片、塑料吸瓶、吸水紙等。

  四、實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)

  一、小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與觀察

  1、處理:用1.5mg/kg秋水仙素腹腔注射處理小鼠(注射量為0.1ml/10g體重)。即用以上配制的秋水仙溶液按每10g體重注射0.1ml。注射后24小時(shí),可以取骨

  2、處死:斷頸法處死小鼠。剪刀剪開腿部的皮膚,用鑷子夾住小鼠的股骨,剪去股骨周圍的肌肉,將小鼠的兩股骨取出,擦凈股骨上的肌肉。去股骨的髖面,將吸有2.2%檸檬酸三鈉溶液的小注射器的針頭插入,反復(fù)幾次吹出骨髓細(xì)胞,反復(fù)吹打直至股骨呈白色,制成細(xì)胞懸液。

  3、低滲:將細(xì)胞懸液在1000rpm/min離心5min,棄除上清液,留0.5ml搖勻。向細(xì)胞液中再加入1%的檸檬酸三鈉溶液5ml用吸管輕吹打均勻,在室溫低滲30min。低滲期間,配制固定液,即甲醇:冰醋酸為3:1(v/v),置4℃冰箱中備用。

  4.預(yù)固定(1次):低滲處理后的細(xì)胞懸液離心5分鐘,留1ml原液,搖勻。加入新配制的固定液至6ml,吹打均勻,固定5分鐘,再在1000rpm/min離心3-5min,去掉上清液。

  5、固定(2次):沿離心管壁慢慢加入新配制的固定液6ml,用吸管輕輕吹打均勻,室溫下固定5min,1000rpm/min3min,棄去上清;如此反復(fù)固定兩次(共固定3次)。

  6.根據(jù)管底細(xì)胞量的多少,加入新配制的固定液0.3~0.8ml,用吸管打均勻,使其形成細(xì)胞懸液。

  7.滴片:將預(yù)冷的載玻片(0℃冰。,水平或傾斜45°角放置,用吸管吸取細(xì)胞懸液,從約0.5-1m高處滴1~2滴到片子上,用口將其吹干,靜置使其干燥。

  8.染色:將干燥的玻片放入2ml吉姆薩原液加入40ml磷酸緩沖液(pH6.8)配成的染液中染色20min,用磷酸緩沖液(pH6.8)沖洗,晾干后鏡檢。

  二、微核試驗(yàn)方法:

  1、骨髓的制。簲囝i法處死小鼠。用剪刀剪開腿部的皮膚,用鑷子夾住小鼠的股骨,剪去股骨周圍的肌肉,將小鼠的兩股骨取出,擦凈股骨上的肌肉。去股骨的髖面,將吸有0.85%Nacl生理等滲液小注射器的針頭插入,反復(fù)幾次吹出骨髓細(xì)胞。反復(fù)吹打使其混合均勻,制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液在1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,棄除上清液。2、涂片:在離心管中加入少量的小牛血清(約0.3ml)混勻后,按血常規(guī)涂片法涂片,長度約2cm~3cm(涂片時(shí)一次涂成)。在空氣中晾干。

  3、固定:將干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。即使當(dāng)日不染色,也應(yīng)固定后保存。

  4、染色:將固定過的涂片放入Giemsa應(yīng)用液中,染色20min~30min,然后立即用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。

  5、封片:用濾紙及時(shí)擦干染片背面的水滴,再用雙層濾紙輕輕按壓染片,以吸附染片上殘留的水分,再在空氣中晃動(dòng)數(shù)次,以促其盡快晾干,然后放入二甲苯中透明5min,取出滴上適量光學(xué)樹脂膠,蓋上蓋玻片,寫好標(biāo)簽。

  每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞,觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù),微核率以千分率表示。

  數(shù)據(jù)處理:利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS的單因素方差分析或t檢驗(yàn)等方法,進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如后表)。

  五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法

  微核試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)總表1:

  受試物

  劑量mg/Kg

  組別

  各受試小鼠1000個(gè)受檢細(xì)胞中含微核細(xì)胞數(shù)

  1

  2

  3

  4

  5

  6

  7

  8

  對苯二酚

  120

  1

  38

  33

  35

  37

  34

  35

  36

  30

  80

  2

  28

  31

  30

  32

  29

  28

  33

  27

  40

  3

  20

  25

  21

  23

  28

  26

  24

  22

  秋水仙素

  3

  1

  36

  33

  32

  34

  35

  31

  31

  37

  1.5

  2

  29

  25

  23

  26

  24

  27

  25

  24

  1

  3

  24

  21

  23

  20

  19

  25

  22

  19

  氯化汞

  3

  1

  22

  25

  20

  26

  21

  23

  22

  18

  2

  2

  16

  22

  21

  19

  20

  18

  17

  15

  1

  3

  13

  17

  15

  16

  14

  15

  17

  13

  陰性對照蒸餾水

  3

  2

  1

  4

  3

  5

  3

  9

  陽性對照環(huán)磷酰胺

  40mg/kg體重

  38

  44

  45

  40

  36

  41

  43

  39

  表2

  對苯二酚對動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率

  組

  別

  劑量

  動(dòng)物數(shù)

  受檢細(xì)胞數(shù)

  含微核細(xì)胞數(shù)

  微核率

  P值

  (g/kg體重)

  (只)

  (個(gè))

  (個(gè))

  (‰)

  受試物

  120

  8

  8000

  對苯二酚

  80

  8

  8000

  40

  8

  8000

  溶劑對照(蒸餾水)

  8

  8000

  陽性物對照

  環(huán)磷酰胺

  (mg/kg體重)

  40

  6.參考文獻(xiàn)

  [1]孟紫強(qiáng),阮愛東,桑楠等.SO2污染對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的誘發(fā)作用.環(huán)境科學(xué),20xx,23(4)123-125.

  [2]孟紫強(qiáng),桑楠,張波等.二氧化硫體內(nèi)衍生物誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的效應(yīng).環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),20xx,20(2)239-243.

  [3]耿德貴,王秀琴,劉士旺等.除草劑使它隆對黃鱔細(xì)胞的致突變作用研究.環(huán)境與健康雜志,20xx,17(2)103-105.

  [4]周曉蓉,李百祥,邱向紅等.小鼠骨髓及肝血中嗜多染紅細(xì)胞微核率的比較.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,1999,13(1)66-67.

  [5]

  曹佳.微核實(shí)驗(yàn)在中國的應(yīng)用、發(fā)展與展望.遺傳,20xx,25(1)73-76.

  二.實(shí)驗(yàn)報(bào)告

  1.實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果

  2.對實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論

  3.實(shí)驗(yàn)總結(jié)

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